اصول کشف اولیه مواد مخدر

  • 2022-09-26

تهیه یک داروی جدید از ایده اصلی تا راه اندازی یک محصول نهایی یک فرایند پیچیده است که می تواند 12-15 سال طول بکشد و بیش از 1 میلیارد دلار هزینه کند. ایده یک هدف می تواند از منابع مختلفی از جمله تحقیقات دانشگاهی و بالینی و از بخش تجاری حاصل شود. ممکن است قبل از انتخاب یک هدف برای یک برنامه پرهزینه برای کشف مواد مخدر ، سالها طول بکشد. پس از انتخاب هدف ، صنعت داروسازی و اخیراً برخی از مراکز دانشگاهی تعدادی از فرآیندهای اولیه را برای شناسایی مولکول هایی که دارای ویژگی های مناسب برای تهیه داروهای قابل قبول هستند ، ساده کرده اند. در این بررسی به مراحل کلیدی بالینی فرآیند کشف دارو ، از شناسایی و اعتبار اولیه هدف اولیه ، از طریق توسعه سنجش ، غربالگری توان بالا ، شناسایی HIT ، بهینه سازی سرب و در نهایت انتخاب یک مولکول نامزد برای توسعه بالینی می پردازیم.

واژه‌های کلیدی: کشف مواد مخدر ، غربالگری توان بالا ، شناسایی هدف ، اعتبار سنجی هدف ، سری HIT ، توسعه سنجش ، آبشار غربالگری ، بهینه سازی سرب

مقدمه

یک برنامه کشف مواد مخدر آغاز می شود زیرا یک بیماری یا وضعیت بالینی بدون محصولات پزشکی مناسب وجود دارد و این نیاز بالینی برآورده نشده است که انگیزه اصلی رانندگی برای این پروژه است. تحقیقات اولیه ، که اغلب در آکادمی اتفاق می افتد ، داده هایی را برای ایجاد فرضیه ایجاد می کند که مهار یا فعال شدن پروتئین یا مسیر منجر به اثر درمانی در حالت بیماری خواهد شد. نتیجه این فعالیت ، انتخاب یک هدف است که ممکن است قبل از پیشرفت در مرحله کشف سرب به منظور توجیه تلاش برای کشف مواد مخدر نیاز به اعتبار بیشتر داشته باشد (شکل 1). در حین کشف سرب ، یک جستجوی فشرده برای یافتن یک مولکول کوچک مانند مواد مخدر یا درمانی بیولوژیکی ، که به طور معمول نامزد توسعه نامیده می شود ، به دست می آید ، که به پیشرفت بالینی و در صورت موفقیت ، در توسعه بالینی پیشرفت می کند (شکل 2) و در نهایت یک داروی بازاریابی است.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is bph0162-1239-f1.jpg

فرآیند کشف مواد مخدر از شناسه هدف و اعتبار سنجی از طریق تشکیل یک ترکیب و بازه زمانی تقریبی برای این فرآیندها. FDA ، سازمان غذا و داروی ؛Ind ، داروی جدید تحقیقاتی ؛NDA ، برنامه جدید دارویی.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is bph0162-1239-f2.jpg

نمای کلی از سنجش غربالگری کشف مواد مخدر.

شناسایی هدف

داروها به دو دلیل اصلی در کلینیک شکست می خورند. نکته اول این است که آنها کار نمی کنند و دوم این است که آنها در امان نیستند. به همین ترتیب ، یکی از مهمترین مراحل تهیه داروی جدید ، شناسایی و اعتبار سنجی هدف است. هدف یک اصطلاح گسترده است که می تواند برای طیف وسیعی از موجودات بیولوژیکی اعمال شود که ممکن است به عنوان مثال پروتئین ها ، ژن ها و RNA را شامل شود. یک هدف خوب باید کارآمد ، ایمن باشد ، نیازهای بالینی و تجاری را برآورده کند و مهمتر از همه ، "دارویی" باشد. یک هدف "قابل دارو" برای مولکول داروی قلمداد قابل دسترسی است ، به این ترتیب که یک مولکول کوچک یا بیولوژیکی بزرگتر و با اتصال ، یک پاسخ بیولوژیکی ایجاد می کند که ممکن است هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن اندازه گیری شود. اکنون مشخص شده است که کلاسهای خاص برای کشف داروی مولکول کوچک ، به عنوان مثال ، گیرنده های همراه با پروتئین G (GPCR) قابل تحمل هستند ، در حالی که آنتی بادی ها در مسدود کردن تعامل پروتئین/پروتئین خوب هستند. شناسایی و اعتبار سنجی هدف خوب باعث افزایش اعتماد به نفس در رابطه بین هدف و بیماری می شود و به ما امکان می دهد تا بررسی کنیم که آیا مدولاسیون هدف منجر به عوارض جانبی مبتنی بر مکانیسم خواهد شد.

داده کاوی داده های زیست پزشکی موجود منجر به افزایش قابل توجهی در شناسایی هدف شده است. در این زمینه ، داده کاوی به استفاده از یک رویکرد بیوانفورماتیک اشاره دارد که نه تنها در شناسایی بلکه انتخاب و اولویت بندی اهداف بالقوه بیماری کمک می کند (یانگ و همکاران ، 2009). داده های موجود از منابع مختلفی تهیه شده است اما شامل نشریات و اطلاعات ثبت اختراع ، داده های بیان ژن ، داده های پروتئومیکس ، فنوتیپ تراریخته و داده های پروفایل مرکب است. رویکردهای شناسایی همچنین شامل بررسی سطح mRNA/پروتئین برای تعیین اینکه آیا آنها در بیماری بیان شده اند و آیا با تشدید بیماری یا پیشرفت ارتباط دارند. به عنوان مثال ، یکی دیگر از رویکردهای قدرتمند این است که به دنبال ارتباطات ژنتیکی باشید ، این است که بین پلی مورفیسم ژنتیکی و خطر ابتلا به بیماری یا پیشرفت بیماری وجود داشته باشد یا پلی مورفیسم عملکردی باشد. به عنوان مثال ، بیماران مبتلا به بیماری آلزایمر خانوادگی (AD) معمولاً در پروتئین پیش ساز آمیلوئید یا ژنهای پرنسیلین جهش دارند که منجر به تولید و رسوب در مغز افزایش مقادیر پپتید Abeta ، مشخصه AD می شود (Bertram and Tanzi ، 2008). همچنین نمونه هایی از فنوتیپ ها در انسان وجود دارد که جهش ها می توانند گیرنده را باطل یا بیش از حد فعال کنند ، به عنوان مثال ، کانال سدیم با ولتاژ NAV1. 7 ، هر دو جهش به ترتیب یک فنوتیپ درد ، عدم حساسیت یا حساسیت به ترتیب ایجاد می کنند (یانگ و همکاران ، 2004 ؛ کاکسو همکاران ، 2006).

یک روش جایگزین استفاده از غربالگری فنوتیپی برای شناسایی اهداف مرتبط با بیماری است. در یک آزمایش زیبا ، Kurosawa و همکاران.(2008) برای جداسازی آنتی بادی های مونوکلونال انسانی (MABS) که به سطح سلولهای تومور متصل می شود ، از یک کتابخانه آنتی بادی فاژ استفاده کرد. کلون ها به صورت جداگانه توسط سیستم ایمنی مورد بررسی قرار گرفتند و آنهایی که ترجیحاً و به شدت رنگ آمیزی سلولهای بدخیم انتخاب شدند. آنتی ژن های شناخته شده توسط آن کلونها توسط سیستم ایمنی بدن جدا شده و توسط طیف سنجی جرمی شناسایی شدند. از 2114 MABS با توالی منحصر به فرد ، آنها 21 آنتی ژن مجزا را که بر روی چندین کارسینوما بیان شده است ، شناسایی کردند ، که برخی از آنها ممکن است اهداف مفیدی برای درمان سرطان مربوطه و چندین MABS باشد که ممکن است به عوامل درمانی تبدیل شوند.

اعتبار سنجی هدف

پس از شناسایی ، هدف باید به طور کامل تحت پیگرد قانونی قرار گیرد. تکنیک های اعتبار سنجی از ابزارهای آزمایشگاهی از طریق استفاده از مدلهای کامل حیوانات ، تا تعدیل یک هدف مورد نظر در بیماران بیماری متغیر است. در حالی که هر رویکرد به خودی خود معتبر است ، اعتماد به نفس در نتیجه مشاهده شده با یک رویکرد چند اعتبار سنجی به طور قابل توجهی افزایش می یابد (شکل 3).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is bph0162-1239-f3.jpg

شناسه هدف و اعتبار سنجی یک فرآیند چند منظوره است. IHC ، ایمونوهیستوشیمی.

فناوری ضد حساس یک تکنیک بالقوه قدرتمند است که از الیگونوکلئوتیدهای شیمیایی اصلاح شده مانند RNA استفاده می کند که به گونه ای طراحی شده است که برای منطقه ای از یک مولکول mRNA هدف تعریف شود (Henning and Beste ، 2002). اتصال الیگونوکلئوتید آنتی بادی به mRNA هدف از اتصال ماشین آلات ترجمه جلوگیری می کند و در نتیجه سنتز پروتئین رمزگذاری شده را مسدود می کند. نمونه بارز قدرت فناوری ضد حساس توسط محققان آزمایشگاههای ابوت که پروب های ضد حساسیت به گیرنده P2X3 موش صحرایی ایجاد کرده اند ، نشان داده شده است (Honore et al. ، 2002). هنگامی که توسط minipump داخل رحمی داده شد ، برای جلوگیری از سمیت های مرتبط با تزریق بولوس ، الیگونوکلنوکلئوتیدهای فسفرروتیوات P2X3 فعالیت ضد هیپرالژیک را در مدل کمکی کامل فروند نشان داده بودند ، و نقش آشکاری برای این گیرنده در حالت های التهابی مزمن نشان می داد. جالب اینجاست که پس از تجویز الیگونوکلنوکلئوتیدهای آنتی بادی قطع شد ، عملکرد گیرنده و پاسخهای آلگزی بازگشت. بنابراین ، بر خلاف رویکرد حذفی ژن ، اثرات الیگونوکلئوتید ضد حساس قابل برگشت است و حضور مداوم آنتی بادی برای مهار پروتئین هدف مورد نیاز است (Peet ، 2003). با این حال ، شیمی مرتبط با ایجاد الیگونوکلئوتیدها منجر به مولکول هایی با فراهمی زیستی محدود و سمیت تلفظ شده شده است ، و باعث می شود از داخل بدن استفاده کنند. این امر با اقدامات غیر اختصاصی ، مشکلات مربوط به کنترل این ابزارها و عدم تنوع و تنوع در انتخاب پروب های نوکلئوتیدی مناسب پیچیده شده است (Henning and Beste ، 2002).

در مقابل، حیوانات تراریخته یک ابزار اعتبارسنجی جذاب هستند زیرا حیوانات کامل را درگیر می‌کنند و امکان مشاهده نقاط پایانی فنوتیپی را برای روشن کردن پیامدهای عملکردی دستکاری ژن فراهم می‌کنند. در روزهای اولیه هدف قرار دادن ژن، حیواناتی تولید شدند که از ابتدا و در طول زندگی خود فاقد عملکرد یک ژن خاص بودند. این کار بینش بزرگی را در مورد عملکردهای in vivo طیف وسیعی از ژن ها به همراه داشت. یکی از این نمونه ها استفاده از موش حذفی P2X7 برای تایید نقش این کانال یونی در ایجاد و حفظ دردهای عصبی و التهابی است (Chessell et al., 2005). در موش‌های فاقد گیرنده‌های P2X7، حساسیت بیش از حد التهابی و نوروپاتیک به طور کامل به محرک‌های مکانیکی و حرارتی وجود ندارد، در حالی که پردازش درد طبیعی حفظ می‌شود. این حیوانات تراریخته همچنین برای تأیید مکانیسم عمل این فرسایش در داخل بدن مورد استفاده قرار گرفتند زیرا موش‌های تراریخته قادر به آزادسازی سیتوکین پیش‌التهابی بالغ IL-1بتا از سلول‌ها نبودند، اگرچه هیچ کمبودی در بیان mRNA IL-1β وجود نداشت. جایگزینی برای ناک اوت های ژنی، ناک اوت های ژنی است که در آن یک پروتئین غیر آنزیمی جایگزین پروتئین درون زا می شود. این حیوانات می توانند فنوتیپ متفاوتی نسبت به ناک اوت داشته باشند، برای مثال زمانی که پروتئین دارای عملکردهای ساختاری و همچنین آنزیمی است (Abell et al., 2005) و این موش ها ظاهراً باید آنچه را که در طول درمان با داروها اتفاق می افتد تقلید کنند. پروتئین وجود دارد اما از نظر عملکردی مهار می شود.

اخیراً ، تمایل به ایجاد حذفی محدود به بافت و/یا القاء شده افزایش یافته است. اگرچه این رویکردها از نظر فنی چالش برانگیز هستند ، اما بارزترین دلیل این امر نیاز به غلبه بر مرگ و میر جنینی حیوانات تهی هموزیگوت است. دلایل دیگر شامل اجتناب از مکانیسم های جبرانی به دلیل عدم وجود مزمن عملکرد رمزگذاری شده ژن و جلوگیری از فنوتیپ های رشد است. با این حال ، استفاده از حیوانات تراریخته گران و وقت گیر است. بنابراین برای دور زدن برخی از این موارد ، استفاده از RNA تداخل کوچک (siRNA) برای اعتبار سنجی هدف به طور فزاینده ای محبوب شده است. RNA دو رشته (DSRNA) مخصوص ژن که باید خاموش شود به یک سلول یا ارگانیسم معرفی می شود ، جایی که به عنوان ماده ژنتیکی اگزوژن شناخته می شود و مسیر RNAi را فعال می کند. پروتئین ریبونوکلئاز فعال شده است که DSRNA ها را به هم متصل می کند و به هم می ریزد تا قطعات دو رشته ای از جفت پایه 21-25 را با چند پایه بیش از حد بدون جفت در هر انتها تولید کند. این قطعات کوتاه دو رشته ای siRNA ها نامیده می شوند. این siRNA ها سپس به رشته های تک از هم جدا شده و در یک مجموعه خاموش کننده فعال ناشی از RNA (RISC) ادغام می شوند. پس از ادغام در RISC ، جفت پایه SiRNAS به mRNA هدف خود و القاء شکاف mRNA ، از این طریق مانع از استفاده از آن به عنوان الگوی ترجمه می شود (در Castanotto و Rossi ، 2009). با این حال ، فناوری RNAi هنوز مشکل اصلی تحویل به سلول هدف را دارد ، اما بسیاری از سیستم های تحویل ویروسی و غیر ویروسی در حال حاضر تحت بررسی هستند (برای بررسی ، به Whitehead و همکاران ، 2009 مراجعه کنید).

آنتی بادی های مونوکلونال یک ابزار عالی برای اعتبار سنجی هدف هستند زیرا آنها با یک منطقه بزرگتر از سطح مولکول هدف در تعامل هستند و باعث می شود تبعیض بهتری بین اهداف حتی از نزدیک و غالباً ایجاد میل بالاتری داشته باشد. در مقابل ، مولکول های کوچک از نیاز به تعامل با محل فعال اغلب محافظت شده از یک هدف محروم می شوند ، در حالی که آنتی بادی ها را می توان برای اتصال به اپی توپ های منحصر به فرد انتخاب کرد. این ویژگی نفیس پایه و اساس عدم وجود سمیت غیر مکانیکی (یا "خارج از هدف" آنها است-یک مزیت اصلی در مورد داروهای مولکول کوچک.

با این حال ، آنتی بادی ها نمی توانند از غشای سلولی که کلاس هدف را به طور عمده به سطح سلول و پروتئین های ترشح شده محدود می کنند ، عبور کنند. یکی از نمونه های چشمگیر اثربخشی یک مابا در داخل بدن ، عملکرد خنثی کننده آنتی بادی ضد ترامون MNAC13 است ، که نشان داده شده است که هم درد نوروپاتی و هم حساسیت التهابی را کاهش می دهد (اوگولینی و همکاران ، 2007) ، در نتیجه NGF در شروع کار را نشان می دهدو حفظ درد مزمن. سرانجام ، ابزار اعتبار سنجی هدف کلاسیک ، مولکول کوچک فعال زیستی است که با پروتئین های مؤثر با و تعدیل می کند.

اخیراً ، ژنومیک شیمیایی ، یک کاربرد سیستمیک از مولکول های ابزار برای شناسایی و اعتبار سنجی هدف قرار گرفته است. ژنومیک شیمیایی را می توان به عنوان مطالعه پاسخ های ژنومی به ترکیبات شیمیایی تعریف کرد. هدف شناسایی سریع داروهای جدید و اهداف دارویی است که چندین فن آوری کشف داروهای اولیه فاز اولیه اعم از شناسایی و اعتبار سنجی هدف ، بیش از طراحی ترکیب و سنتز شیمیایی تا آزمایش بیولوژیکی را در بر می گیرد. ژنومیک شیمیایی کتابخانه های شیمیایی تنوع گرا و سنجش های سلولی با اطلاعات بالا را به همراه انفورماتیک و ابزارهای معدن لازم برای ذخیره و تجزیه و تحلیل داده های تولید شده گرد هم می آورد (بررسی شده در Zanders و همکاران ، 2002). هدف نهایی این رویکرد ارائه ابزارهای شیمیایی در برابر هر پروتئین رمزگذاری شده توسط ژنوم است. هدف استفاده از این ابزارها برای ارزیابی عملکرد تلفن همراه قبل از سرمایه گذاری کامل در هدف و تعهد به یک کمپین غربالگری است

روند کشف هیت

پس از فرآیند اعتبار سنجی هدف ، در طول شناسایی HIT و مرحله کشف سرب فرآیند کشف مواد مخدر است که سنجش های غربالگری ترکیبی توسعه می یابد. یک مولکول "ضربه" می تواند از نظر محققان مختلف متفاوت باشد اما در این بررسی ما یک ضربه را به عنوان یک ترکیب تعریف می کنیم که فعالیت مورد نظر را در یک صفحه نمایش ترکیبی دارد و فعالیت آن پس از آزمایش مجدد تأیید می شود. انواع پارادایم های غربالگری برای شناسایی مولکول های ضربه ای وجود دارد (جدول 1 را ببینید). غربالگری توان بالا (HTS) شامل غربالگری کل کتابخانه مرکب به طور مستقیم در برابر هدف دارو یا در یک سیستم سنجش پیچیده تر ، مانند یک روش مبتنی بر سلول ، که فعالیت آن به هدف بستگی دارد اما پس از آن نیاز به سنجش های ثانویه داردبرای تأیید محل عمل ترکیبات (فاکس و همکاران ، 2006). این الگوی غربالگری شامل استفاده از اتوماسیون آزمایشگاهی پیچیده است اما هیچ دانش قبلی از ماهیت شیمیوتیپ را که احتمالاً فعالیت در پروتئین هدف دارد ، فرض نمی کند. غربالگری متمرکز یا دانش مبتنی بر دانش شامل انتخاب از کتابخانه شیمیایی زیر مجموعه های کوچکتر مولکولها است که احتمالاً بر اساس دانش پروتئین هدف و ادبیات یا موارد حق ثبت اختراع برای کلاسهای شیمیایی فعالیت در پروتئین هدف دارند که احتمالاً در هدف دارو فعالیت دارند(بوپانا و همکاران ، 2009). این نوع دانش ، اخیراً به پارادایم های کشف اولیه با استفاده از فارماکوفور ها و مدل سازی مولکولی برای انجام صفحه های مجازی از پایگاه داده های مرکب افزایش یافته است (مکینز ، 2007). غربالگری قطعه شامل تولید کتابخانه های ترکیبی با وزن مولکولی بسیار کوچک است که در غلظت های بالا غربال می شوند و به طور معمول با تولید ساختارهای پروتئین همراه است تا پیشرفت ترکیب را فعال کند (قانون و همکاران ، 2009). سرانجام ، یک روش غربالگری متمرکز تخصصی نیز می تواند در نظر گرفته شود ، غربالگری فیزیولوژیکی. این یک رویکرد مبتنی بر بافت است و به دنبال پاسخی است که بیشتر با اثر نهایی در داخل بدن مورد نظر قرار می گیرد و بر خلاف هدف قرار دادن یک جزء مولکولی خاص است.

میز 1

صفحه نمایششرحنظرات
توانتعداد زیادی از ترکیبات مورد تجزیه و تحلیل در یک روش که عموماً برای اجرای در صفحات 384 چاه و بالاتر طراحی شده استمجموعه های بزرگ مرکب اغلب توسط Big Pharma اجرا می شوند اما بانک های مرکب کوچکتر نیز می توانند در داروسازی یا آکادمی اجرا شوند که می تواند به کاهش هزینه ها کمک کند. شرکت ها همچنین اکنون در تلاشند تا با استفاده از تجزیه و تحلیل با کمک رایانه ، در فضای شیمیایی گسترده ای پوشش دهند تا تعداد ترکیبات نمایش داده شده را کاهش دهند.
صفحه متمرکزترکیباتی که قبلاً به عنوان برخورد به کلاسهای خاص اهداف (به عنوان مثال کینازها) و ترکیبات با ساختارهای مشابه شناخته شده بودندمی تواند یک خیابان ارزان تر برای پیدا کردن یک مولکول ضربه ای فراهم کند اما ساختارهای کاملاً جدید ممکن است کشف نشود و ممکن است در دستیابی به موقعیت ثبت اختراع در یک منطقه IP کاملاً پوشیده از مشکل وجود داشته باشد
صفحه قطعه قطعهترکیبات کوچک را در کریستال ها خیس کنید تا ترکیباتی با فعالیت میلی متر کمتری بدست آورید که می تواند به عنوان بلوک های ساختمانی برای مولکول های بزرگتر استفاده شودمی تواند قطعات منتخب را به هم بپیوندد تا در فضای شیمیایی قرار بگیرد تا قدرت را افزایش دهد. برای در دسترس بودن ساختار کریستالی نیاز دارد
طراحی داروی ساختاریاستفاده از سازه های کریستالی برای کمک به طراحی مولکول هااغلب به عنوان کمکی برای سایر استراتژی های غربالگری در Big Pharma استفاده می شود. در این حالت معمولاً یک ترکیب را به کریستال متصل کرده و از این استفاده می کند تا پیش بینی کند که در آن می توان تغییرات را اضافه کرد تا قدرت یا انتخاب بیشتری را فراهم کند
صفحه مجازیمدل های docking: interogation یک کتابخانه مجازی مجازی با ساختار اشعه ایکس پروتئین یا در صورت داشتن لیگاند شناخته شده ، به عنوان پایه ای برای توسعه ترکیبات بیشتر درمی تواند ساختارهای شروع را برای یک صفحه متمرکز بدون نیاز به استفاده از صفحه نمایش های گران قیمت کتابخانه فراهم کند. همچنین می توان از آن برای جستجوی فضای ثبت اختراع جدید در اطراف سازه های مرکب موجود استفاده کرد
صفحه نمایش فیزیولوژیکییک رویکرد مبتنی بر بافت فدرال اثرات یک دارو در بافت به جای سطح سلولی یا درون سلولی ، به عنوان مثال ، انقباض عضلاتصفحه نمایش های توان پایین. هدف این است که از پیچیدگی بافت به جای اینکه فقط به خواندن تک آهنگ بپردازیم ، تقلید کنید. ممکن است برای غربالگری تعداد کمتری از ترکیبات به متخصصان دانشگاهی در منطقه بیماری جذاب باشد تا یک بیماری بیشتر در مورد بیماری انجام شود
صفحه نمایش NMRترکیبات کوچک (قطعات) را با خیساندن به اهداف پروتئین ساختار کریستال یا NMR شناخته شده برای جستجوی بازدیدهایی با فعالیت MM کم که می تواند به عنوان بلوک های ساختمانی برای مولکول های بزرگتر استفاده شود ، صفحه نمایش دهید.استفاده از NMR به عنوان یک ابزار تعیین کننده ساختار

NMR ، رزونانس مغناطیسی هسته ای.

توان بالا و سایر صفحه نمایش های ترکیبی توسعه داده شده و برای شناسایی مولکول هایی که با هدف دارو تعامل دارند ، برنامه های شیمی برای بهبود قدرت ، انتخاب و خصوصیات فیزیولوژیکی مولکول اجرا می شوند و داده ها برای پشتیبانی از فرضیه ای که مداخله در آن ایجاد می شود ، توسعه می یابدهدف دارو در وضعیت بیماری اثربخشی خواهد داشت. این مجموعه فعالیتهایی است که موضوع فعالیت شدید در صنعت داروسازی و به طور فزاینده ای در آکادمی ها برای شناسایی مولکول های نامزد برای توسعه بالینی است. شرکت های داروسازی سازمان های بزرگی را با هدف شناسایی اهداف ، مونتاژ مجموعه های مرکب و زیرساخت های مرتبط برای غربالگری این ترکیبات برای شناسایی مولکول های مورد نظر در ابتدا از HTS یا سایر الگوی غربالگری و بهینه سازی آن دسته از غربالگری به نامزدهای بالینی ساخته اند. در سالهای اخیر ، بخش دانشگاهی به طور فزاینده ای به فعالیتهایی که به طور سنتی در مرحله کشف سرب در صنعت داروسازی انجام می شود ، علاقه مند شده است. دانشمندان دانشگاهی اکنون در حال قالب بندی سنجش برای کشف مواد مخدر هستند که برای غربالگری ترکیبی به مراکز کشف مواد مخدر دانشگاهی منتقل می شوند. این مراکز ، همانطور که توسط ابتکار نقشه راه NIH در ایالات متحده مثال زده شده است (Frearson and Collie ، 2009) ، کتابخانه های مرکب ، غربالگری زیرساخت ها و تخصص های مناسب را که به طور سنتی در بخش صنعتی یافت می شود ، برای غربالگری پروتئین های هدف برای شناسایی پروب های به اصطلاح شیمیایی ایجاد کرده اند. استفاده در اعتبار سنجی هدف و مطالعات زیست شناسی بیماری و به طور فزاینده ای برای شناسایی نقاط شروع شیمیایی برای برنامه های کشف دارو. موفقیت این تلاش ها با انتقال مهارت بین بخش های صنعتی و دانشگاهی تسهیل شده است.

یک مسیر مهم برنامه مهم در مرحله کشف سرب شامل تعدادی از فعالیت ها است و با توسعه سنجش های بیولوژیکی برای شناسایی مولکول ها با فعالیت در هدف دارو استفاده می شود. پس از توسعه ، از چنین سنجشی برای نمایش کتابخانه های مرکب برای شناسایی مولکول های مورد علاقه استفاده می شود. خروجی یک صفحه نمایش ترکیبی به طور معمول یک مولکول HIT نامیده می شود ، که نشان داده شده است که فعالیت خاصی در پروتئین هدف دارد. بازدیدهای غربالگری اساس یک برنامه شیمی بهینه سازی سرب را برای افزایش قدرت سری شیمیایی در پروتئین هدف اصلی دارو تشکیل می دهد. در طول کشف سرب ، مولکول های فاز نیز در سنجش های مبتنی بر سلول پیش بینی کننده وضعیت بیماری و در مدل های حیوانی بیماری مورد بررسی قرار می گیرند تا هم اثربخشی ترکیب و هم مشخصات ایمنی احتمالی آن را مشخص کنند (شکل 2). پاراگرافهای زیر با جزئیات بیشتر الزامات و کاربرد سنجش های غربالگری ترکیبی را در کشف هیت و سرب توضیح می دهد.

توسعه سنج

در دوران نوترکیب ، اکثر سنجش های مورد استفاده در صنعت به ایجاد خطوط سلولی پایدار پستانداران بیش از حد بیان هدف علاقه یا بیان بیش از حد و تصفیه پروتئین نوترکیب برای ایجاد سنجش های به اصطلاح بیوشیمیایی متکی هستند ، اگرچه در اخیر اخیرسالها افزایش در تعداد گزارش ها در مورد استفاده از سیستم های سلولی اولیه برای غربالگری ترکیبات افزایش یافته است (Dunne et al. ، 2009). به طور کلی ، سنجش های مبتنی بر سلول برای کلاسهای هدف مانند گیرنده های غشایی ، کانال های یونی و گیرنده های هسته ای اعمال شده و به طور معمول خواندن عملکردی را به عنوان یک نتیجه از فعالیت مرکب تولید می کنند (میشلینی و همکاران ، 2010). در مقابل ، سنجش های بیوشیمیایی ، که برای هر دو هدف گیرنده و آنزیم اعمال شده است ، اغلب به سادگی میل ترکیبی از ترکیب آزمایش را برای پروتئین هدف اندازه گیری می کنند. شایستگی نسبی سنجش های بیوشیمیایی و مبتنی بر سلول به طور گسترده مورد بحث قرار گرفته و در جای دیگر مورد بررسی قرار گرفته است (مور و ریس ، 2001). هر دو پارادایم سنجش با موفقیت برای شناسایی مولکول های هیت و نامزد استفاده شده است.

مجموعه ای از قالب های سنجش برای پشتیبانی از غربالگری ترکیبی فعال شده است. انتخاب فرمت سنجش بستگی به زیست شناسی پروتئین هدف دارو ، زیرساخت تجهیزات در آزمایشگاه میزبان ، تجربه دانشمندان در آن آزمایشگاه ، خواه یک مهار کننده یا مولکول فعال کننده و مقیاس صفحه نمایش ترکیبی دارد. به عنوان مثال ، سنجش غربالگری ترکیبی در GPCR برای اندازه گیری میل اتصال یک لیگاند رادیویی یا فلورسانس به گیرنده ، برای اندازه گیری تبادل نوکلئوتید گوانین در سطح پروتئین G ، برای اندازه گیری تغییرات با واسطه ترکیب در یکی از تنظیمات ترکیب شده ، پیکربندی شده است. تعدادی از متابولیت های مسنجر دوم از جمله کلسیم ، اردوگاه یا فسفاتهای اینوزیتیول یا برای اندازه گیری فعال شدن ژنهای گزارشگر پایین دست. هر چه قالب سنجش انتخاب شده باشد ، این یک الزام است که عوامل زیر در نظر گرفته شود:

ارتباط دارویی سنجش. در صورت وجود ، مطالعات باید با استفاده از لیگاند های شناخته شده با فعالیت در هدف مورد مطالعه انجام شود تا مشخص شود که آیا فارماکولوژی سنجش پیش بینی وضعیت بیماری است و نشان می دهد که این روش قادر به شناسایی ترکیبات با قدرت و مکانیسم عمل است.

تکرارپذیری سنجش. در یک محیط غربالگری ترکیبی ، این یک الزام است که سنجش در سراسر صفحات سنجش ، در طول روزهای صفحه نمایش و در برنامه ای که ممکن است برای چندین سال اجرا شود ، در طول مدت کل برنامه کشف مواد مخدر قابل تکرار است.

هزینه های سنجشسنجش غربالگری ترکیبی به طور معمول در صفحات میکروتیتری انجام می شود. در آکادمی یا برای تعداد نسبتاً کمی از سنجش ترکیبات به طور معمول در صفحات میکروتیتری 96 چاه یا 384 چاه قالب بندی می شوند در حالی که در صنعت یا در برنامه های کاربردی HTS در صفحات میکروتیر 384 چاه یا 1536 چاه در حجم اندازه گیری به اندازه اندازه های کوچک به عنوان یک اندازه کوچک به صورت کوچک شکل می گیرند. چند میکرولیتیر. در هر مورد ، معرفها و حجم سنجش برای به حداقل رساندن هزینه های سنجش انتخاب می شوند.

کیفیت سنجشکیفیت سنجش به طور معمول با توجه به فاکتور z تعیین می شود (ژانگ و همکاران ، 1999). این یک پارامتر آماری است که علاوه بر در نظر گرفتن پنجره سیگنال در سنجش ، واریانس پیرامون سیگنال های بالا و پایین را در سنجش نیز در نظر می گیرد. فاکتور Z به وسیله استاندارد صنعت برای اندازه گیری کیفیت سنجش در پایه های صفحه تبدیل شده است. فاکتور Z دارای طیف وسیعی از 0 تا 1 است. سنجش با ضریب Z بیشتر از 0. 4 برای غربالگری ترکیب مناسب در نظر گرفته می شود اگرچه بسیاری از گروه ها ترجیح می دهند با سنجش هایی با فاکتور Z بیشتر از 0. 6 کار کنند. علاوه بر کیفیت سنجش Z Factor نیز از طریق گنجاندن کنترل های دارویی در هر روش کنترل می شود. اگر دارویی ترکیب (های) استاندارد در محدوده از پیش تعریف شده قرار بگیرد ، سنجش قابل قبول تلقی می شود. کیفیت سنجش تحت تأثیر عوامل بسیاری قرار دارد. به طور کلی ، سنجش های با کیفیت بالا از طریق اجرای پروتکل های سنجش ساده با چند مرحله ، به حداقل رساندن مراحل شستشو یا صفحه به صفحه انتقال معرف در داخل سنجش ، با استفاده از معرفها و بیولوژیک های پایدار ، و از طریق اطمینان از تمام ابزارهای مورد استفاده برای انجام این کار ایجاد می شود. سنجش بهینه انجام می شود. این به طور معمول از طریق توسعه شیوه های کنترل کیفیت برای کلیه موارد اتوماسیون آزمایشگاهی حاصل می شود (به http://www. ncgc. nih. gov/guidance/section2. html#replice-experiment-study-summary-acceptance مراجعه کنید).

تأثیر ترکیبات در روش. کتابخانه های شیمیایی به طور معمول در حلال های آلی مانند اتانول یا دی متیل سولفوکسید (DMSO) ذخیره می شوند. بنابراین ، سنجش ها باید پیکربندی شوند که نسبت به غلظت حلال های مورد استفاده در روش حساس نیستند. به طور معمول ، سنجش های مبتنی بر سلول نسبت به غلظت حلال بیش از 1 ٪ DMSO غیرقابل تحمل هستند ، در حالی که سنجش های بیوشیمیایی را می توان در غلظت حلال تا 10 ٪ DMSO انجام داد. مطالعات همچنین برای تعیین نرخ ضربه مثبت منفی و کاذب در روش انجام شده است. اگر این موارد غیرقابل قبول باشد ، نیاز به تنظیم مجدد نیاز دارد. سرانجام باید به غلظت غربالگری توجه شود. سنجش غربالگری ترکیبی برای کشف HIT به طور معمول با غلظت ترکیب 1-10 میکرومتر اجرا می شود. در این غلظت ترکیبات با فعالیت حداکثر 40 میکرومتر قابل شناسایی است. برای شناسایی ترکیبات با فعالیت بالاتر یا پایین می توان غلظت آزمایش را متنوع کرد.

یک نمونه از فناوری HTS که برای شناسایی مولکول های HIT با فعالیت در GPCR ها اجرا شده است ، روش Aequorin است (Stables et al. ، 2000). Aequorin یک پروتئین بیولومینسانس حساس به کلسیم است که از چتر دریایی Aequorea Victorea کلون شده است. رده های سلولی پایدار پستانداران برای بیان هدف داروی GPCR و بیوسنسور Aequorin ایجاد شده اند. برای گیرنده های قادر به اتصال به پروتئین های G هتروتریمریک از خانواده GαQ/11 ، فعال سازی لیگاند منجر به افزایش غلظت کلسیم داخل سلولی می شود. هنگامی که Aequorin در همان سلولها بیان می شود ، این افزایش غلظت کلسیم داخل سلولی به عنوان یک نتیجه از اتصال کلسیم به فتوپروتئین آکوورین ، که در حضور کوفکتور کوئلنترازین ، منجر به تولید فلاش نور می شود که می توان تشخیص داددر یک لومیومتر مبتنی بر صفحه میکروتیتری مانند سکوی Lumilux (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، USA). سنجش Aequorin دارای یک پروتکل بسیار ساده است و برای HTS در قالب صفحه پلاک 1536 در حجم سنجش 6 میکرولیتر و برای فعالیتهای پروفایل مرکب در قالب صفحه 384 چاه تهیه شده است.

هنگام توسعه هر روش HTS ، که می تواند در طی چند هفته چندین میلیون مولکول را در بر بگیرد ، بهترین کار برای نمایش مجموعه های آموزش ترکیبات برای تأیید اینکه این روش به طور قابل قبول انجام می شود. شکل 4 غربالگری یک آموزش ترکیبی 12000 در برابر گیرنده Histamine H1 بیان شده در سلولهای تخمدان همستر چینی در یک روش HTS با فرمت چاه 1536 را نشان می دهد. مجموعه آموزش به طور معمول در دو یا سه نوبت اجرا می شود تا نرخ ضربه در روش ، تکرارپذیری سنجش و نرخ ضربه منفی مثبت و کاذب در روش را مشخص کند. به طور معمول ، بسته های آماری برای شناسایی این پارامترها تهیه شده است. هنگامی که برای تشخیص لیگاند های آگونیست غربالگری می شود ، نرخ ضربه در روش Aequorin به طور معمول کمتر از 0. 5 ٪ از ترکیبات غربالگری با برش آماری 5 ٪ یا کمتر از سیگنال آگونیست که با یک لیگاند آگونیست استاندارد دیده می شود ، هستند. در این فرمت سنجش نرخ ضربه منفی مثبت و کاذب بسیار پایین است. برای غربالگری آنتاگونیست نرخ ضربه در روش Aequorin به طور معمول از 2-3 ٪ از ترکیبات غربالگری با قطع فعالیت بیش از 25 ٪ مهار است. این یک پدیده رایج از همه سنجش های غربالگری است. نرخ ضربه در آنتاگونیست یا قالب مهار کننده تمایل به بالاتر از نرخ ضربه در سنجش آگونیست به عنوان سنجش آنتاگونیست ، که با تشخیص کاهش سیگنال سنجش تعریف می شوند ، همچنین ترکیباتی را که در تولید سیگنال دخالت می کنند ، تشخیص می دهد. پس از اتمام آزمایش استحکام ، یک سنجش به HTS منتقل می شود. در طول HTS ، حداکثر 200 صفحات سنجش هر روز غربال می شوند ، که اغلب با استفاده از اتوماسیون آزمایشگاهی پیچیده. در طول صفحه نمایش ، عملکرد سنجش با توجه به Z 'در صفحه سنجش و واریانس در فارماکولوژی یک ترکیب استاندارد اندازه گیری می شود ، در صورت عدم موفقیت در صفحات سنجش در صورت عدم وجود این اقدامات کنترل کیفیت در خارج از محدوده های از پیش تعریف شده (شکل 5).

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is bph0162-1239-f4.jpg

غربالگری توان بالا Aquorin: آزمایش اعتبار سنجی آنتاگونیست GPCR (1536-چاه). اعتبار سنجی سنجش یک روش غربالگری داروی GPCR برای شناسایی لیگاند های آگونیست و آنتاگونیست. سلولهای بیان کننده هیستامین H1 و آکورین آکورین حساس به کلسیم به کلسیم در صفحات میکروتیتری 1536 چاه توزیع شدند. در مجموع 12000 ترکیب به صورت تکراری برای شناسایی لیگاندهای آگونیست (پانل سمت چپ) و لیگاندهای آنتاگونیست (پانل سمت راست) نمایش داده شدند. در روش آگونیست (پانل سمت چپ) ، هیچ پاسخ دارویی به رنگ قرمز نشان داده نشده است ، پاسخ به غلظت حداکثر هیستامین لیگاند در داده های آبی و ترکیبی به رنگ زرد. همانطور که به طور معمول در سنجش های آگونیستی مشاهده می شود ، به دلیل عدم وجود مثبت کاذب ، میزان ضربه بسیار پایین است. در روش آنتاگونیست (پانل سمت راست) ، پاسخ به هیستامین در غیاب ترکیب آزمایش به رنگ قرمز (پاسخ پایه) ، پاسخ به غلظت حداکثر یک آنتاگونیست هیستامین در آبی (مهار 100 ٪) و داده های ترکیبی به رنگ زرد نشان داده شده است. وادهمانطور که به طور معمول در یک روش مهار کننده مبتنی بر سلول مشاهده می شود ، به دلیل ترکیبی از تداخل سنجش و فعالیت مرکب ، داده های ترکیبی قابل توجهی وجود دارد. فعالان واقعی در محدوده 40 تا 100 ٪ مهار ارتباط دارند. هر دو روش Z عالی دارند. GPCR ، گیرنده همراه با پروتئین G.

An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is bph0162-1239-f5.jpg

کنترل کیفیت (QC) در غربالگری توان بالا. برای اطمینان از کنترل داده های غربالگری در کمپین های غربالگری ترکیبی ، هر صفحه سنجش به طور معمول حاوی تعدادی از ترکیبات کنترل دارویی است.(الف) هر صفحه 384 چاه حاوی 16 چاه حاوی کنترل کم و 16 چاه دیگر حاوی غلظت EC100 از یک استاندارد دارویی است که برای محاسبه فاکتور z استفاده می شود (مرجع ژانگ و همکاران ، 1999). صفحاتی که یک عامل z زیر 0. 4 تولید می کنند ، از بین می روند.(ب) هر صفحه همچنین شامل 16 چاه یک EC است50غلظت یک استاندارد دارویی برای نظارت بر واریانس در سنجش (الماس).(ج) نقشه گرما برای کلیه صفحاتی که از QC استاندارد دارویی عبور می کنند برای نظارت بر توزیع فعالیت در صفحه سنجش ایجاد می شود. انتظار می رود که توزیع تصادفی از فعالیت را در صفحه غربالگری مشاهده کند. صفحه ای مانند آن ارائه شده به دلیل خوشه بندی چاه های فعال در مرکز صفحه ، شکست خورده و از آن نجات می یابد.

تعریف یک سریال هیت

كتابخانه های مرکب مونتاژ شده اند تا حاوی مولكول های وزن مولكولی كوچك باشند كه از پارامترهای شیمیایی مانند قانون لیپینسكی پنج (لیپینسکی و همكاران ، 2001) پیروی می كنند ، و بیشتر اوقات دارای وزن مولكولی كمتر از 400 و CLOGP هستند (اندازه گیری لیپوفیلیس كه تحت تأثیر قرار می گیرد. جذب به بدن) کمتر از 4 4 مولکول با این ویژگی ها "مانند مواد مخدر" نامیده شده اند ، به این دلیل که اکثر داروهای بالینی به بازار عرضه شده دارای وزن مولکولی کمتر از 350 و CLOGP کمتر از 3 هستندبرای بهبود قدرت و انتخاب ، شروع یک برنامه کشف دارویی با یک مولکول کوچک ساده به عنوان بهینه سازی سرب بسیار مهم است ، به طور معمول شامل افزایش وزن مولکولی است که به نوبه خود می تواند منجر به ایمنی و تحمل شود.

هنگامی که تعدادی از بازدید از غربالگری مجازی یا HTS به دست آمد ، اولین نقش برای تیم کشف مواد مخدر این است که سعی کنید تعریف کنید که کدام ترکیبات بهترین کار را دارند. این روند تریاژ ضروری است زیرا ، از یک کتابخانه بزرگ ، یک تیم احتمالاً با بازدیدهای ممکن که نیاز به کاهش ، تأیید و خوشه ای در سری دارند ، باقی می ماند. چندین مرحله برای دستیابی به این امر وجود دارد. اول ، اگرچه این مسئله از نظر کیفیت كتابخانه ها كمتر است ، اما ترکیباتی كه توسط مجریان كتابخانه شناخته می شوند ، باید در كارزارهای HTS مكرر كنند. دوم ، تعدادی از الگوریتم های شیمی محاسباتی به منظور بازدیدهای گروهی بر اساس شباهت ساختاری ایجاد شده اند تا اطمینان حاصل شود که طیف گسترده ای از کلاسهای شیمیایی در لیست ترکیبات گرفته شده نشان داده شده است. تجزیه و تحلیل لیست هیت مرکب با استفاده از این الگوریتم ها امکان انتخاب بازدیدها برای پیشرفت را بر اساس خوشه شیمیایی ، قدرت و عواملی مانند راندمان لیگاند فراهم می کند که ایده ای را ارائه می دهد که چگونه یک ترکیب برای اندازه خود به هم متصل می شود (قدرت ورود به سیستم تقسیم بر تعداد "Heavy"اتمها یعنی اتم های غیر هیدروژن ، در یک مولکول).

مرحله بعدی در فرآیند پالایش اولیه تولید منحنی های پاسخ دوز در روش اولیه برای هر ضربه ، ترجیحاً با یک نمونه تازه از ترکیب است. نشان دادن رفتار رقابتی عادی در بازدیدها مهم است. ترکیباتی که پاسخ همه یا هیچ چیز را نشان می دهند ، به صورت برگشت پذیر عمل نمی کنند و در واقع ممکن است به هیچ وجه به پروتئین هدف الزام آور نباشند ، با فعالیت در غلظت های بالا ناشی از تعامل بین نمونه و یک مؤلفه دیگر سیستم سنجش. ترکیبات برگشت پذیر مورد علاقه قرار می گیرند زیرا اثرات آنها می تواند به راحتی پس از ترک مواد مخدر شسته شده باشد ، که در هنگام استفاده در بیماران مورد توجه مهمی قرار دارد. به دست آوردن منحنی دو ز-پاسخ ، تولید غلظت مهاری حداکثر را که برای مقایسه قدرت ترکیبات نامزد استفاده می شود ، امکان پذیر می کند. تهیه و استفاده از نمونه های تازه از ترکیبات برای این تمرین بسیار مطلوب است. تقریباً تمام کتابخانه های HTS به عنوان راه حل های DMSO منجمد ذخیره می شوند و نتیجه ای دارند که پس از مدتی ، این ترکیب می تواند تخریب یا اصلاح شود. تقریباً هرکسی که با کتابخانه هایی از این نوع کار کرده است ، حکایات مربوط به چگونگی ناپدید شدن فعالیت قدرتمند هنگام مجدداً مجدداً در آزمایش مجدد و استفاده در آزمایش مجدد ، اگرچه گاهی اوقات شناسایی ناخالصی های قدرتمند باعث پیشرفت پیشرفت می شود.

با استفاده از منحنی های پاسخ دوز قابل اعتماد در سنجش اولیه برای هدف ، این مرحله برای بررسی بازدیدهای بازمانده در یک روش ثانویه ، در صورت وجود ، برای هدف انتخاب مورد بررسی قرار می گیرد. این نیازی به یک سنجش در قالب توان بالا نیست بلکه شامل بررسی تأثیر ترکیبات در یک پاسخ عملکردی است ، به عنوان مثال در یک روش پیام رسان دوم یا در یک سنجش مبتنی بر سلول یا سلول. فعالیت در این تنظیم اطمینان می دهد که ترکیبات قادر به تعدیل سیستم های دست نخورده تر هستند نه اینکه فقط با پروتئین جدا شده و غالباً مهندسی شده مورد استفاده در روش اولیه استفاده کنند. در طول فرآیند تأیید ، شیمیدانان دارویی به دنبال ترکیبات خوشه ای به گروه هایی هستند که می توانند اساس سری سرب را تشکیل دهند. به عنوان بخشی از این فرآیند ، به خواص هر خوشه ای توجه می شود مانند اینکه آیا یک رابطه ساختار و فعالیت قابل شناسایی (SAR) در حال تحول در تعدادی از ترکیبات است ، یعنی شناسایی گروهی از ترکیبات که برخی از آنها را دارندیا نقوش شیمیایی به طور مشترک و افزودن گروههای شیمیایی مختلف به این ساختار هسته منجر به قدرت های مختلف می شود. موضوعات سنتز شیمیایی نیز مورد بررسی قرار می گیرد. بنابراین ، سهولت آماده سازی ، قابل استفاده بالقوه در سنتز موازی و توانایی تولید تنوع از واسطه های اواخر مرحله ارزیابی می شود.

با خوشه های تعریف شده در حال حاضر یک تمرین می تواند در چندین گروه از ترکیبات به طور موازی انجام شود. این مرحله شامل تولید سریع داده های SAR ابتدایی و تعریف عناصر اساسی در ساختار مرتبط با فعالیت خواهد بود. در عین حال ، نمونه های نماینده هر یک از این سریال های مینی در معرض سنجش های مختلف آزمایشگاهی قرار می گیرند که برای ارائه اطلاعات مهم با توجه به خصوصیات جذب ، توزیع ، متابولیسم و دفع (ADME) و همچنین فیزیکوشیمیایی و فارماکوکینتیک (PK) طراحی شده اند. اندازه گیری ها (جدول 2 را ببینید). پروفایل انتخابی ، به ویژه در برابر انواع اهداف ، در صورت وجود ، که در ابتدا ترکیبات ساخته شده بودند ، در این زمان نیز برای انجام آن مفید است. به عنوان مثال ممکن است بخواهید کیناز X را مهار کنید اما از کیناز Y برای کاهش عوارض جانبی داخل بدن خودداری کنید. این تمرین نقاط قوت و نقص هر سری را نشان می دهد و اجازه می دهد تا در مورد امیدوار کننده ترین سری ترکیبات که پیشرفت می شود ، تصمیمی اتخاذ شود. تعداد سریال های پیش رو در این مرحله به منابع موجود بستگی دارد اما در حالت ایده آل باید چندین مورد در مرحله ضربه به سر باشد تا در مرحله آینده امکان پذیرش را فراهم کند.

  • نویسنده : ملیکا یار محمد تجری
  • منبع : falconvision.online
  • بدون دیدگاه

ثبت دیدگاه

مجموع دیدگاهها : 0در انتظار بررسی : 0انتشار یافته : ۰
قوانین ارسال دیدگاه
  • دیدگاه های ارسال شده توسط شما، پس از تایید توسط تیم مدیریت در وب منتشر خواهد شد.
  • پیام هایی که حاوی تهمت یا افترا باشد منتشر نخواهد شد.
  • پیام هایی که به غیر از زبان فارسی یا غیر مرتبط باشد منتشر نخواهد شد.